遏制非洲猪瘟蔓延 ASF检测实验室如何预防非洲猪瘟？
当地时间20日，意大利北部伦巴第大区一名发言人说，为遏制非洲猪瘟蔓延，该大区12家农场的将近3.4万头生猪已被扑杀。
非洲猪瘟是非洲猪瘟病毒感染猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病，以高热、内脏器官严重出血和高死亡率为特征。非洲猪瘟不是人畜共患病，相关病毒不会感染人类，但被病毒污染的食物或鞋子、工具、车辆等可能助长病毒传播。这种病毒能在非高温条件下长期存活，目前没有可以防治的动物疫苗或特效药。
关于非洲猪瘟及非洲猪瘟PCR实验室
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病病程短，死亡率高，对养猪业危害甚大，为世界动物卫生组织（OIE）规定须通报动物疫病，也是我国重点防控的一类动物疫病。
2018年我国在辽宁省首次报告发现ASF疫情，随后其扩散蔓延到全国其他地区，给我国养猪业带来了极大经济损失。由于ASF的临床症状和病理变化很难与猪瘟等其他疫病区分，并且目前没有有效疫苗可用，因此快速准确的实验室诊断具有重要意义。经典的血吸附试验、病毒分离鉴定等检测诊断方法，对生物安全设施条件要求较高，在试验特异性以及检测时间等方面也有所限制。相比之下，荧光PCR具有较高的敏感性和特异性，可同时快速检测高通量样品，被广泛应用于ASF诊断和检测。
江苏省动物疫病预防控制中心（以下简称疫控中心）作为农业农村部首批授权检测ASFV的兽医实验室，按照农业农村部统一要求，开展ASF确诊工作，并且组织省、市、县及第三方检测机构开展了ASF实验室检测比对，以及授权通过比对的实验室开展有关ASF检测工作。
造成非洲猪瘟检测实验室假阳性的原因
检测功能区域设置不合理检测实验室没有严格按照PCR实验室设计要求，设置相对隔离的4个工作区域。有的实验室尽管分成了4个工作区间，但存在套间现象，比如4个工作区间的门通向同一个准备室，并不真正独立，没有形成有效隔离，并且普遍存在PCR检测区域与外部公共空间没有设置缓冲间的问题，导致PCR实验室与公共走廊没有形成有效隔离。
人员流向、物品流向不合理 根据PCR实验室建设要求，核酸提取区与核酸扩增区之间不应设置传递窗，以阻止扩增室中经过扩增的高浓度核酸片段以气溶胶等形式，经过传递窗回流到核酸提取区，造成污染。另外，有些检测人员没有严格按照“样品准备区→核酸提取区→核酸扩增区”的顺序定向移动，往往穿着同一套工作服从核酸扩增区又回到核酸提取区，造成人为核酸污染。
样品提取与试剂配制未在独立的生物安全柜中进行 按照PCR试验要求，试剂配制区应设有独立的实验室，如果不具备条件，也应该在样品提取区设置独立的生物安全柜，在生物安全柜中配制扩增反应体系。但有些检测人员往往忽视这一要求，在核酸扩增区配制扩增反应体系，配制结束后，PCR管盖不牢或者使用劣质的PCR管，导致扩增产物形成高浓度核酸气溶胶，造成扩增反应体系污染。
检测人员操作不规范、不熟练 不管是样品核酸提取环节，还是扩增体系配制环节，如果试验操作不规范，比如移液器操作不当，容易使移液器与不同试剂和样品之间发生交叉污染，而造成检测结果错误。
试验结束后清洁消毒不彻底 每次试验结束后，未对试验台、仪器设备等进行有效清洁与消毒，导致这些仪器设备表面残留的核酸片段，给下次试验造成潜在污染隐患。
实验室通风设备运转不良 有的实验室尽管设置了通风设备，但由于各种原因不能正常运转，造成实验室空气长期不流通，室内空气中累积大量含核酸片段的气溶胶，从而造成试验污染。
样品或提取模板间交叉污染 样品或模板放置时，由于密封不严而溢于容器外，造成不同样品或不同模板间产生交叉污染。
PCR试剂、产物、阳性质粒污染
试剂 PCR扩增体系配制过程中，未更换移液器枪头、试剂盖未倒置放置、混合用EP管未进行去酶处理、使用普通水稀释引物等均会造成试剂被样品核酸污染。
阳性质粒 ASFV荧光PCR检测试剂盒多使用克隆质粒作为阳性对照，而质粒在单位容积内浓度很高，如有操作不当，极易造成污染。
PCR实验室预防非洲猪瘟的措施
非洲猪瘟是一种严重威胁猪群健康的疾病，因为它没有有效的治疗方法，因此预防非常重要。PCR实验室在非洲猪瘟的监测和诊断中发挥着关键作用。本文将从PCR实验室实际工作中给出一些预防非洲猪瘟的方法。
实验室严格分区：从事分子生物学检测与普通的血凝/血凝抑制（HA/HI）试验、酶联免疫吸附（ELISA）试验不同，微量的核酸污染即可严重影响试验结果的准确性。在设计分子生物学实验室时，必须按照分子生物学试验的具体要求，将实验室严格分隔成试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区、PCR产物分析区等完全独立的功能室，做到对互不相容活动的相邻试验区域形成真正有效的隔离（图1），防止交叉污染的发生。
严格的生物安全措施：确保实验室内外的生物安全措施得到充分执行，以防止非洲猪瘟病毒的传播。这包括限制实验室访问、穿戴适当的防护服、实验室区域的严格消毒和废物处理等。
定期培训：实验室工作人员需要定期接受关于非洲猪瘟的培训，包括识别病症、样本采集、PCR检测等方面的知识。
样本管理：采样、存储和运输样本时必须遵循标准操作规程，以防止病毒的传播。样本应在生物安全柜中处理，并在使用后进行适当的消毒。
实验室设备和设施：确保PCR实验室设备和设施的设计和维护符合生物安全标准，包括使用高效的过滤器、安全柜和洗手设备等。
检测方法：使用高度敏感和特异性的PCR检测方法来检测非洲猪瘟病毒。确保PCR反应中的所有试剂都是高质量的，并进行质控以避免假阳性或假阴性结果。
样本来源追踪：跟踪样本的来源，了解其采集地点和可能的疫情情况，以及采样人员的生物安全培训情况。
监测和报告：建立监测体系，密切监测疫情情况，及时报告任何疑似或确诊的非洲猪瘟病例，以便采取隔离、灭杀和其他控制措施。
国际合作：积极参与国际合作，分享信息和经验，以加强非洲猪瘟的全球监测和控制。
实际上，非洲猪瘟的预防需要严格的生物安全措施、高质量的PCR检测方法和持续的监测努力。
非洲猪瘟PCR实验室如何解决假阳性问题？如何预防非洲猪瘟？
PCR实验对操作人员及实验环境要求是比较严谨的，因为实验的特殊性，从实验前的准备到标本的提取再到核酸的扩增都是一环紧扣一环，各种细节交织在一起，才能保证实验结果的有效性。
也正是如此，除非有明显的错误，否则查找原因时整个实验环节是无法重现的，因为核酸检测是分子实验，检测对象是看不见摸不着的，更多的都是依据经验去模拟事件的发生，通过“案件重演”——重复实验来对实验进行回顾和排查分析，从而解决失控的根源。这里就体现出标准操作规程(SOP)及严格执行SOP的重要性，随意更改流程会增加问题的复杂性和查找原因的难度。
那么，PCR实验室在出现气溶胶等污染时，应该如何去治理预防呢？
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适用于疾病控制中心、微生物实验室、动物房实验室、PCR实验室、分子实验室、P3及P4等实验室。
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