基础实验室：一级和二级生物安全水平

 

本文旨在针对危险度１～４级微生物提出不同等级生物安全水平实验室所应具备的最低要求的指南和建议。虽然其中的一些建议对于某些危险度１级的生物体来说可能没有必要，但是这些建议对于训练工作人员掌握规范（安全）的微生物学操作技术（GMT）来说是必要的。

诊断和卫生保健实验室（以公共卫生、临床或医院为基础的）必须设计成二级或二级以上生 物安全水平。由于没有一个实验室能够完全地控制其所接收的标本，故实验室的操作人员可能会 接触比预期更高危险度的微生物，因此，在制订生物安全计划和政策时要注意到这种可能性。在某些国家，临床实验室必须经过认可。全世界范围都应采纳并实行生物安全标准防护。

关于一级和二级生物安全水平的基础实验室的指南，本手册介绍得较为全面、详尽，因为这些指南对于各级生物安全实验室都是最基本的。后面介绍的三级生物安全水平的防护实验室和四级生物安全水平的最高防护实验室所应遵循的指南，则是对上述指南的修改 和补充，用于操作更危险的病原体。

 

操作规范

本规程中列出了最基本的实验室操作和程序，他们是微生物学操作技术规范的基础。在规划 实验室和国家级实验室项目时，可以根据这些规程来制订实验室安全操作的书面程序。

每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。下面列出了一些最重要的概念。

 

进入规定

1、在处理危险度 2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物 危害警告标志（图 1）。

2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。

3、实验室的门应保持关闭。

4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。

5、进入动物房应当经过特别批准。

6、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。

 

人员防护

1、在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。

2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物 的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。

3、在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。

4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、 面罩（面具）或其他防护设备。

5、严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息 室和卫生间）。

6、不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。

7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。

8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。

9、在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。

图 1 张贴于实验室门上的生物危害警告标志

 

操作规范

1、严禁用口吸移液管。

2、严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。

3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。

4、应限制使用皮下注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液，皮下注射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。

5、出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告。

6、必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。

7、污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。

8、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。

 

实验室工作区

1、实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。

2、发生具有潜在危害性的材料溢出以及在每天工作结束之后，都必须清除工作台面的污染。

3、所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须清除污染。

4、在进行包装和运输时必须遵循国家和∕或国际的相关规定。

5、如果窗户可以打开，则应安装防止节肢动物进入的纱窗。

 

生物安全管理

1、实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或 操作手册。

2、实验室主管（向实验室主任汇报）应当保证提供常规的实验室安全培训。

3、要将生物安全实验室的特殊危害告知实验室人员，同时要求他们阅读生物安全或操作手 册，并遵循标准的操作和规程。实验室主管应当确保所有实验室人员都了解这些要求。实验室内应备有可供取阅的安全或操作手册。

4、应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案。

5、如有必要，应为所有实验室人员提供适宜的医学评估、监测和治疗，并应妥善保存相应 的医学记录。

 

实验室的设计和设施

在设计实验室和安排某些类型的实验工作时，对于那些可能造成安全问题的情况要加以特别 关注，这些情况包括：

1、气溶胶的形成

2、处理大容量和∕或高浓度微生物

3、仪器设备过度拥挤和过多

4、啮齿动物和节肢动物的侵扰

5、未经允许人员进入实验室

6、工作流程：一些特殊标本和试剂的使用。

一级和二级生物安全水平实验室的设计实例分别见图 2 和图 3。

 

图 2 典型的一级生物安全水平实验室（图片由 CUH2A，Princeton，NJ，USA 提供）

 

设计特征

1、必须为实验室安全运行、清洁和维护提供足够的空间。

2、实验室墙壁、天花板和地板应当光滑、易清洁、防渗漏并耐化学品和消毒剂的腐蚀。地板应当防滑。

3、实验台面应是防水的，并可耐消毒剂、酸、碱、有机溶剂和中等热度的作用。

4、应保证实验室内所有活动的照明，避免不必要的反光和闪光。

5、实验室器具应当坚固耐用，在实验台、生物安全柜和其他设备之间及其下面要保证有足 够的空间以便进行清洁。

6、应当有足够的储存空间来摆放随时使用的物品，以免实验台和走廊内混乱。在实验室的工作区外还应当提供另外的可长期使用的储存间。

7、应当为安全操作及储存溶剂、放射性物质、压缩气体和液化气提供足够的空间和设施。

8、在实验室的工作区外应当有存放外衣和私人物品的设施。

9、在实验室的工作区外应当有进食、饮水和休息的场所。

10、每个实验室都应有洗手池，并最好安装在出口处，尽可能用自来水。

11、实验室的门应有可视窗，并达到适当的防火等级，最好能自动关闭。

12、二级生物安全水平时，应在靠近实验室的位置配备高压灭菌器或其他清除污染的工具。

13、安全系统应当包括消防、应急供电、应急淋浴以及洗眼设施。

14、应当配备具有适当装备并易于进入的急救区或急救室。

15、在设计新的设施时，应当考虑设置机械通风系统，以使空气向内单向流动。如果没有机 械通风系统，那么实验室窗户应当能够打开，同时应安装防虫纱窗。

16、必须为实验室提供可靠和高质量的水。要保证实验室水源和饮用水源的供应管道之间没 有交叉连接。应当安装防止逆流装置来保护公共饮水系统。

17、要有可靠和充足的电力供应和应急照明，以保证人员安全离开实验室。备用发电机对于 保证重要设备的正常运转（如培养箱、生物安全柜、冰柜等）以及动物笼具的通风都是必要的。

18、要有可靠和充足的燃气供应。供气设施必须得到良好维护。

19、实验室和动物房偶尔会成为某些人恶意破坏的目标。必须考虑物理和防火安全措施。必 须使用坚固的门、纱窗以及门禁系统。适当时还应使用其他措施来加强安全保障。

 

实验室设备

处理生物安全危害时，使用安全设施并结合规范的操作将有助于降低危险。本节阐述了适用 于所有生物安全实验室的相关设备的基本原则。有关高级别生物安全实验室设备的要求将在相关 章节中阐述。

实验室主任应咨询生物安全官员和安全委员会（如果有），确保配备足量的设备，并能正确 使用。选择设备时应符合一些基本原则，即：

1、在设计上应能阻止或限制操作人员与感染性物质间的接触

2、建筑材料应防水、耐腐蚀并符合结构要求

3、设备装配后应无毛刺、锐角以及易松动的部件

4、设备的设计、建造与安装应便于操作、易于维护、清洁、清除污染和进行质量检验。应尽量避免使用玻璃及其他易碎的物品。

需要详细咨询设备的性能和结构规格，以确保设施具备必要的安全特性。

 

图 3 典型的二级生物安全水平实验室（图片由 CUH2A，Princeton，

NJ，USA 提供）。在生物安全柜中进行可能发生气溶胶的操作程序。 门保持关闭并贴上适当的危险标志。潜在被污染的废弃物同普通废弃。

 

 

基本生物安全设备

1、移液辅助器——避免用口吸的方式移液。有不同设计的多种产品可供使用。

2、生物安全柜，在以下情况使用： —— 处理感染性物质；如果使用密封的安全离心杯，并在生物安全柜内装样、取样，则 这类材料可在开放实验室离心 —— 空气传播感染的危险增大时 —— 进行极有可能产生气溶胶的操作时（包括离心、研磨、混匀、剧烈摇动、超声破碎、 打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及 从动物或卵胚采集感染性组织）。

3、一次性塑料接种环，也可在生物安全柜内使用电加热接种环，以减少生成气溶胶。

4、螺口盖试管及瓶子。

5、用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具。

6、一次性巴斯德塑料移液管，尽量避免使用玻璃制品。

7、在投入使用前，像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。

 

健康和医学监测

主管机构有责任通过实验室主任来确保实验室全体工作人员接受适当的健康监测。监测的目 的是监控职业获得性疾病。为达到这些目的，应进行如下工作：

1、根据需要提供主动或被动免疫

2、促进实验室感染的早期检测

3、应禁止高度易感人群（如孕妇或免疫损伤人员）在高危险实验室中工作

4、提供有效的个体防护装备和方法。

在一级生物安全水平操作微生物的实验室工作人员的监测指南

历史证据表明，在一级生物安全水平操作的微生物不太可能引起人类疾病或兽医学意义的动 物疾病。但理想的做法是，所有实验室工作人员应进行上岗前的体检，并记录其病史。疾病和实 验室意外事故应迅速报告，所有工作人员都应意识到应用规范的实验室操作技术的重要性。

 

在二级生物安全水平操作微生物的实验室工作人员的监测指南

1、必须有录用前或上岗前的体检。记录个人病史，并进行一次有目的的职业健康评估。

2、实验室管理人员要保存工作人员的疾病和缺勤记录。

3、育龄期妇女应知道某些微生物（如风疹病毒）的职业暴露对未出生孩子的危害。保护胎 儿的正确措施因妇女可能接触的微生物而异。

 

培训

人为的失误和不规范的操作会极大地影响所采取的安全措施对实验室人员的防护效果。因此， 熟悉如何识别与控制实验室危害的、有安全意识的工作人员，是预防实验室感染、差错和事故的关 键。基于这一原因，不断地进行安全措施方面的在职培训是非常必要的。一个有效的安全规程首先 始于实验室管理者，管理者应确保将安全的实验室操作及程序融合到工作人员的基本培训中。安全 措施方面的培训是新工作人员岗前培训的有机组成部分，应向工作人员介绍生物安全操作规范和实 验室操作指南，包括安全手册或操作手册。应采用诸如签名传阅的方法，来确保工作人员阅读并理 解了这些规程。实验室主管在对属下工作人员进行规范性实验室操作技术培训时起关键作用，生物 安全官员可以帮助进行人员培训并研制教具和教案。

 

人员培训的内容应始终包括如何采用安全的方法来进行下列所有实验室工作人员都会经常 遇到的高危操作，包括：

1、吸入危险（气溶胶产物），如使用接种环、划线接种琼脂平板、移液、制作涂片、打开 培养物、采集血液／血清标本、离心等

2、食入危险，如处理标本、涂片以及培养物

3、在使用注射器和针头时刺伤皮肤的危险

4、处理动物时被咬伤、抓伤

5、处理血液以及其他有潜在病理学危害的材料

6、感染性材料的清除污染和处理。

 

废弃物处理

废弃物是指将要丢弃的所有物品。

在实验室内，废弃物最终的处理方式与其污染被清除的情况是紧密相关的。对于日常用品而 言，很少有污染材料需要真正清除出实验室或销毁。大多数的玻璃器皿、仪器以及实验服都可以 重复或再使用。废弃物处理的首要原则是所有感染性材料必须在实验室内清除污染、高压灭菌或 焚烧。

用以处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品，在被丢弃前应考虑的主要问题 有：

1、是否已采取规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒？

2、如果没有，他们是否以规定的方式包裹，以便就地焚烧或运送到其他有焚烧设施的地方进 行处理？

3、丢弃已清除污染的物品时，是否会对直接参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃 物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？

 

清除污染

高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。需要清除污染并丢弃的物品应装在容器中（如根据内容物是否需要进行高压灭菌和／或焚烧而采用不同颜色标记的可以高压灭菌的塑料袋）。也可采用其他可以除去和／或杀灭微生物的替代方法。

 

污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序

要对感染性物质及其包装物进行鉴别并分别进行处理，相关工作要遵守国家和国际规定。废 弃物可以分成以下几类：

1、可重复或再使用，或按普通“家庭”废弃物丢弃的非污染（非感染性）废弃物

2、污染（感染性）锐器——皮下注射用针头、手术刀、刀子及破碎玻璃；这些废弃物应收 集在带盖的不易刺破的容器内，并按感染性物质处理

3、通过高压灭菌和清洗来清除污染后重复或再使用的污染材料

4、高压灭菌后丢弃的污染材料

5、直接焚烧的污染材料。

 

锐器

皮下注射针头用过后不应再重复使用，包括不能从注射器上取下、回套针头护套、截断等， 应将其完整地置于盛放锐器的一次性容器中。单独使用或带针头使用的一次性注射器应放在盛放 锐器的一次性容器内焚烧，如需要可先高压灭菌。

盛放锐器的一次性容器必须是不易刺破的，而且不能将容器装得过满。当达到容量的四分之 三时，应将其放入“感染性废弃物”的容器中进行焚烧，如果实验室规程需要，可以先进行高压灭菌处理。盛放锐器的一次性容器绝对不能丢弃于垃圾场。

高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料

任何高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料不应事先清洗，任何必要的清洗、 修复必须在高压灭菌或消毒后进行。

 

废弃的污染（有潜在感染性）材料

除了锐器按上面的方法进行处理以外，所有其他污染（有潜在感染性）材料在丢弃前应放置 在防渗漏的容器（如有颜色标记的可高压灭菌塑料袋）中高压灭菌。高压灭菌后，物品可以放在 运输容器中运送至焚烧炉。如果可能，即使在清除污染后，卫生保健单位的废弃物也不应丢弃到 垃圾场。如果实验室中配有焚烧炉，则可以免去高压灭菌：污染材料应放在指定的容器（如有 颜色标记的袋子）内直接运送到焚烧炉中。可重复使用的运输容器应是防渗漏的，有密闭的盖 子。这些容器在送回实验室再次使用前，应进行消毒清洁。

应在每个工作台上放置盛放废弃物的容器、盘子或广口瓶，最好是不易破碎的容器（如塑料制品）。当使用消毒剂时，应使废弃物充分接触消毒剂（即不能有气泡阻隔），并根据所使用消 毒剂的不同保持适当接触时间。盛放废弃物的容器在重新使用前应高压灭菌并清 洗。

污染材料的焚烧必须得到公共卫生、环保部门以及实验室生物安全官员的批准。

 

化学品、火、电、辐射以及仪器设备安全

化学品、火、电或辐射事故可以间接导致病原微生物屏障系统的破坏。因此，所有微生物实 验室在这些方面必须坚持很高的安全标准。国家或地方的主管部门通常会制订相关的法规和条 例，必要时可以从他们那里寻求帮助。

 

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